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DNAの濃度と純度の測定DNAの濃度と純度の測定

分光光度計で出来ること

分光光度計ではDNAの濃度測定やDNA以外のコンタミネーションを調べる事が出来ます。

DNAは光路長が1cmのセルで測定した時に、260nmでの吸光度1.0が50µg/mlに相当するので、以下の式よりDNAの濃度を算出する事が出来ます。

DNA濃度=吸光度×50µg/ml×希釈率

またタンパク質が280nmに極大吸収を持ち、タンパク質の混入があると280nmと260nmへの吸光度の影響がある事から、(260nmの吸光度)÷(280nmの吸光度)の値(レシオ)を算出する事でDNAが綺麗かどうかを判断する事が出来ます。この場合、1.8〜2.0の間に入ると綺麗なDNAであるといえるでしょう。

ところで、レシオが1.8〜2.0の間に入っているのに、分光光度計から算出されたDNA濃度とアガロースゲルから算出されたDNA濃度に大きなズレがあるという経験はないでしょうか?
これはDNA以外の夾雑物が大きな原因です。そこでDNAは230nmに極小吸収を持つので、(260nmの吸光度)÷(230nmの吸光度)の値を算出してください。この値が1.8以上であればDNAが綺麗であると言えるでしょう。

※もちろん十分な濃度のあるDNAを使用しないと正しい値からずれてしまいます。

でもそれでは分光光度計の機能が勿体無くないですか?
一度は190nmから350nmまでのスペクトルを測定してみましょう。
下図のようなデータは出てきたでしょうか?

例えばこんなデータが出ていませんでしょうか?

そう、これがアガロースゲルと分光光度計から算出されたDNA濃度に大きな差がある原因です。原因は何でしょう?原因を考えてみて下さい。

綺麗なDNAでお仕事をしてみませんか?


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