STR(マイクロサテライト)解析
幅広く使用されている、有用なゲノムマーカーの1 つです。繰り返し配列の回数がサンプル間で異なるので遺伝子多型の情報となり、その解析結果をジェノタイプサマリとしてレポートすることができます。哺乳類や植物の多型解析はもちろん、２つのDNA ソースが混在しているマイクロキメラ状態の検出・定量にも最適な方法です。
ヒトSTRプライマーセット
12種類のSTRローカスを1度に同定できます。
- 骨髄移植後にドナー・レシピエントどちらの細胞が定着しているかを確認
細胞の由来を調べることに加え、どちらの細胞がどの程度混入しているかも見ることができます。 - 研究で使用しているセルラインが単一細胞由来であるかを確認
近年、研究に使用しているセルラインの単一性が問われています。
STRプライマーセットはそのセルラインが単一であることを証明することができます。
STR解析実践編
実践例1：骨髄移植後の血液細胞由来の検出
STRプライマーセットを使って１つのローカスのアリルを同定しました。ローカスD18S51のアリルはDNAサンプルAでは１７,１８(Fig1)、DNAサンプルBでは１４，１５（Fig2）のヘテロザイゴートと同定されました。これらのサンプルを混合して得られたデータからその混合比率を計算するとDNAサンプルAの比率は50%と計算されました。
実践例2：FLT3による予後調査
Fms-Like Tyrosin Kinese3 (FLT3)はキナーゼ活性を持つ膜タンパクで、急性骨髄性白血病（AML）で最も良く見られる遺伝子の変異です。変異は膜貫通部位にみられ、Internal Tandem Duplication (IDT)とよばれ遺伝子の長さにミューテーションを起こしています。FLT3-IDT変異はAML患者に見られ、その生命予後は不良であるという研究報告があります。GeXPのフラグメント解析でFLT3の長さを調べることができます。
MLPA解析
近年注目を浴びているMLPA(Multiplex Ligation-Dependant Probe Amplification)にGeXPは最適です。MLPAでは遺伝性腫瘍、染色体転座、メチル化のパターンなどがんに関与する遺伝子を調べることができます。
AFLP解析
配列情報が未知な遺伝子の多型を調べるのに有用な方法です。多数のフラグメントが検出されるAFLPフィンガープリントでは、サンプル間の差異を発見することは大変な作業となりますが、GeXPのドミナントスコアリング機能は、サンプル間のフラグメントの有無を簡単に検出します。
T-RFLP解析
腸内細菌や土壌菌などのプロファイルによく使われる方法です。サンプリングしてきた検体を培養などのバイアスにかけることなく、そのまま使用できるので自然に近い状態の細菌叢プロファイルを見ることができます。ピークの強さは細菌の存在量に比例するので、経時的な変化などもモニターすることができます。
実践例：アメリカのエネルギー省のプロジェクト
・海洋中の有害窒素をエサとして取り込んで浄化するバクテリアの観察
サンプリングの時期や、水質改善の状況によって存在するバクテリアの種類、量などが異なります。
SNPs解析
ゴールドスタンダードの一塩基伸長法（Single Primer Extension）でSNPs を検出します。SNPs 解析のために開発されたアルゴリズムは、さまざまな組み合わせのSNPs を的確に同定します。16 分間の泳動で複数のSNPs サイトを同時に検出することも可能なので、より多くのSNPs を短時間で検出することができます。
一塩基伸長法 (Single Base Extension Technology)
Single-Based Primer Extension とは、テンプレートDNAのSNP部位の1塩基手前が3’
末端となるように設定したプライマーと、蛍光標識したddNTP を加えて1 塩基の伸長反応を行うことにより、SNP 部位のターゲット塩基に対して相補的なddNTP がプライマーに結合した蛍光標識されたDNA 断片を作る手法です。
マルチプレックスSNP 解析を行う場合は、プライマーの5’末端側にpolyA やpolyT テールを配置する事でDNA 断片の長さを調節します。
この蛍光標識されたDNA 断片をGeXPで分析することでSNP 解析が可能となります。
たった16分間の泳動時間で10個のSNPsの判定ができます。
TiLLing解析
SNPsの存在をスクリーニングする方法です。この実験方法ではSNPsの存在を教えてくれることに加え、その位置情報も知ることができます。
SNPs実践例
実践例1：血液凝固因子Factor Vの変異（Factor V R506Q）
Factor Vの変異は静脈製血栓症のリスクファクターとして知られており、20%の突発性血栓症、60%の妊婦の血栓症の原因となっています。このファクターの変異は血液凝固に関して正常ですが、血栓を融解する反応に抵抗するため、血栓が融解せず残り血栓症を起こします。Factor V R506Qの変異は506番目のアミノ酸をコードする遺伝子が一塩基変異しがR(アルギニン)からQ(グルタミン)に変異しています。
実践例2：JAK2ポイントミューテーション
CNV (Copy Number Variation)解析
正常な遺伝子配列であっても、そのコピー数の違いによって病態を示す場合があります。GeXP独自のXP-PCRを応用して複数遺伝子コピー数を一度に測定することができます。
→GeXPを使ったCNV研究の論文 L. *Arning et al., Neurogenetics 9, 295 (Oct, 2008).
MSI (Microsatellite Instability (不安定性)解析
大腸がんなどでがん化した細胞に見られるマイクロサテライト不安定性。正常細胞に比べ特定のマイクロサテライトが伸長してきます。GeXPでは伸長によって起こる長さの違いを的確に検出することができます。
AリピートのマイクロサテライトなのでTaq DNAポリメラーゼがスリップを起こし1ベースサイズ違いのPCR産物ができるため、複数のピークが検出されます。GeXPでは1ベースの違いも確実に分離できます。このようなピークはソフトウエアに標準装備されているエクスクルージョンフィルターを利用することでデータとして必要なピークを容易に抽出することができます。
LOH (Lost of Heterozygosity)解析
ヒトの染色体は2倍体で存在しています。がん化することにより遺伝子の片方が欠損してしまう場合があります。フラグメント解析の場合そのピークの強さはDNA量と比例しているので片方の遺伝子が欠損してしまうとそのシグナルが弱くなり、遺伝子が欠損していることがわかります。
皆様からの、課題解決のためのご相談をお待ちしております。
