キット内容物の保存条件
抽出精製プロトコール
（1）キット初回使用時のみのステップ：Proteinase Kに専用バッファー（PK Buffer）を下記用量（40mg/mL）加え、よく溶解する（高濃度の溶液のため、泡立ちに気をつけながら溶解する）。溶液はマイナス20℃で保存する。
＊50サンプル用キット（FormaPure Kit - SmallもしくはFormaPure Starter Kit）の場合は、PKチューブにProteinase K Bufferを直接加える。96サンプル用キット（FormaPure Kit - Medium）あるいは384サンプル用キット（FormaPure Kit - Large）の場合は、別の容器で溶解する。
（2）キット初回使用時のみのステップ：Wash Bufferに 100%イソプロパノールを下記用量で加える。よく混和し、室温に保存する。
＊ステップ（1）（2）はキット初回使用時のみのステップ。2回目以降のキット使用は下記ステップ1より始める。
- 1サンプルあたり20uLのBinding Buffer IIと300uLの100%イソプロパノールを混合する（用事調整：例 10サンプルの場合、200uLのBinding Buffer IIと3mLの100%イソプロパノールを混和する）。
- チューブもしくは96ウェルプレートに、Lysis Bufferを200uL分注する。
- FFPE切片（10ミクロンを1〜5切片：10mgまで）をチューブもしくは96ウェルプレートに入れ、70〜72℃で60分インキュベート。
＊このインキュベーションを過度に行うとRNAにダメージを与える場合があるので注意が必要。 - ステップ（1）で調整したPK溶液20uLを加え、よく混和する（ピペッティング2回以上）。
- 55℃で60分インキュベートする。続いて2分間、氷上で冷やす。
- 上記ステップ5のライゼートを、新たなチューブもしくは96ウェルプレートに移す。
- 150uLのBind I Bufferと、ステップ１で調整した320uLのBind II Bufferを加える。ピペッティング5回以上でよく混ぜた後、55℃で5分間インキュベートする。
- Magnetic 6-tube StandもしくはRing Super Magnet Plate上で5分間静地。 ＊溶液が透明になったことを確認した上で次のステップに進む。
- Magnetic 6-tube StandもしくはRing Super Magnet Plate上に、チューブもしくは96ウェルプレートを静地したまま、磁性ビーズに触れないように溶液をピペッティングで吸い取る。
＊この操作はMagnetic 6-tube Standにチューブを静置いたまま、もしくはRing Super Magnet Plate上に96ウェルプレートを静地したまま行う。寄せられた磁性ビーズが溶液内で崩れてしまった場合は、数uLの上清を残す。RNAのみの抽出：ステップ13に進む（DNase処理を行う場合はステップ10〜12の洗浄は必要無い）。
DNAおよびRNAの同時抽出：下記ステップに進む。 - Magnetic 6-tube StandもしくはRing Super Magnet Plateから、チューブもしくは96ウェルプレートを移動させ、300uLのWash Bufferを加える。ピペッティング5回以上でよく混和後、1分間放置。
- 続いて Magnetic 6-tube StandもしくはRing Super Magnet Plate上で、チューブもしくは96ウェルプレートを1分間静地。
＊溶液が透明になったことを確認した上で次のステップに進む。 - 磁性ビーズに触れないように溶液をピペッティングで吸い取る。
＊この操作はMagnetic 6-tube Standにチューブを静置いたまま、もしくはRing Super Magnet Plate上に96ウェルプレートを静地したまま行う。寄せられた磁性ビーズが溶液内で崩れてしまった場合は、数uLの上清を残す。 - Magnetic 6-tube StandもしくはRing Super Magnet Plateから、チューブもしくは96ウェルプレートを移動させ、750uLの70%エタノールを加える。ピペッティング5回以上で磁性ビーズを良く混和する。
- Magnetic 6-tube StandもしくはRing Super Magnet Plate上に、チューブもしくは96ウェルプレートを1分間静地。
＊溶液が透明になったことを確認した上で次のステップに進む。 - 磁性ビーズに触れないように溶液をピペッティングで吸い取る。
＊この操作はMagnetic 6-tube Standにチューブを静置いたまま、もしくはRing Super Magnet Plate上に96ウェルプレートを静地したまま行う。寄せられた磁性ビーズが溶液内で崩れてしまった場合は、数uLの上清を残す。RNAのみの抽出：下記ステップに進む。
DNAおよびRNAの同時抽出：ステップ21に進む。 - Magnetic 6-tube StandもしくはRing Super Magnet Plateから、チューブもしくは96ウェルプレートを移動させ、調整した100uLのDNase溶液を加える。
＊DNase溶液を用事調整する―80uLのヌクレアーゼフリー水と、10uLの10X DNase buffer（cat# 8170G,、Ambion社）、10uLのDNaseI（cat#2222、Ambion社）を混和する。 - ピペッティング5回以上でDNase溶液と磁性ビーズを良く混和後、37℃で15分間インキュベートする。
- 550uLのWash Bufferを加え、ピペッティング5回以上で良く混合する。その後、室温で10分間インキュベート。
＊DNase溶液を除かず、ステップ20後のチューブもしくは96ウェルプレートに直接Wash Bufferを加える。 - Magnetic 6-tube StandもしくはRing Super Magnet Plate上に、チューブもしくは96ウェルプレートを10分間静地。
＊溶液が透明になったことを確認した上で次のステップに進む。 - 磁性ビーズに触れないように溶液をピペッティングで吸い取る。
＊この操作はMagnetic 6-tube Standにチューブを静置いたまま、もしくはRing Super Magnet Plate上に96ウェルプレートを静地したまま行う。寄せられた磁性ビーズが溶液内で崩れてしまった場合は、数uLの上清を残す。 - Magnetic 6-tube StandもしくはRing Super Magnet Plateから、チューブもしくは96ウェルプレートを移動させ、750uLの70%エタノールを加える。ピペッティング5回以上で磁性ビーズを良く混和する。
- Magnetic 6-tube StandもしくはRing Super Magnet Plate上に、チューブもしくは96ウェルプレートを5分間静地。
＊溶液が透明になったことを確認した上で次のステップに進む。 - 磁性ビーズに触れないように溶液をピペッティングで吸い取る。
＊この操作はMagnetic 6-tube Standにチューブを静置いたまま、もしくはRing Super Magnet Plate上に96ウェルプレートを静地したまま行う。寄せられた磁性ビーズが溶液内で崩れてしまった場合は、数uLの上清を残す。 - Magnetic 6-tube StandもしくはRing Super Magnet Plateから、チューブもしくは96ウェルプレートを移動させ、500uLの90%イソプロパノールを加える。ピペッティング5回以上で磁性ビーズを良く混和後、70℃で3分間インキュベートする。
- Magnetic 6-tube StandもしくはRing Super Magnet Plate上に、チューブもしくは96ウェルプレートを1分間静地
＊溶液が透明になったことを確認した上で次のステップに進む。 - 磁性ビーズに触れないように溶液をピペッティングで吸い取る。 ＊この操作はMagnetic 6-tube Standにチューブを静置いたまま、もしくはRing Super Magnet Plate上に96ウェルプレートを静地したまま行う。
- 27〜30の90%イソプロパノールによる洗浄ステップをもう1度繰り返す。
- Magnetic 6-tube StandもしくはRing Super Magnet Plateから、チューブもしくは96ウェルプレートを移動させ、750uLの70%エタノールを加える。ピペッティング5回以上で磁性ビーズを良く混和する。
- Magnetic 6-tube StandもしくはRing Super Magnet Plate上に、チューブもしくは96ウェルプレートを1分間静地。
＊溶液が透明になったことを確認した上で次のステップに進む。 - 磁性ビーズに触れないように溶液をピペッティングで吸い取る。
＊この操作はMagnetic 6-tube Standにチューブを静置いたまま、もしくはRing Super Magnet Plate上に96ウェルプレートを静地したまま行う。寄せられた磁性ビーズが溶液内で崩れてしまった場合は、数uLの上清を残す。 - 10分間静地し、風乾。
＊エタノールの残留が見えないまで十分静地するが、過度に風乾しない。 - Magnetic 6-tube StandもしくはRing Super Magnet Plateから、チューブもしくは96ウェルプレートを移動させ、80uLのヌクレアーゼフリー水を加える。ピペッティング5回以上で磁性ビーズをリサスペンド後、65〜70℃で30秒間インキュベートする。
＊溶出液量はサンプル量や下流のアプリケーションに合わせて変動させることができるが、少なくとも40uLは必要。潜在的な磁性ビーズのキャリーオーバーのリスクを減らすためには、溶出液量を増やす。 - Magnetic 6-tube StandもしくはRing Super Magnet Plate上に、チューブもしくは96ウェルプレートを移し、1分間静地後、核酸溶出液を分取する。
＊溶液が透明になったことを確認した上で溶出液を分取する。
